IFNα具有抗病毒作用和免疫调节作用。IFNα是通过激活抗病毒蛋白，后者再抑制乙肝病毒RNA转录而发挥抗病毒作用，实际上这也是广义的免疫调节作用。 乙肝病毒DNA复制周期开始于共价闭合环状DNA(cccDNA)转录为前基因组RNA。cccDNA可十分稳定的存在于肝细胞核中。HBV一旦感染人体， cccDNA就难以消失。乙肝病毒携带者，肝细胞分裂为子代细胞时，cccDNA随之也复制到子代肝细胞中;而乙型肝炎病人，肝细胞大量坏死后，肝脏再生新的细胞，cccDNA就会重新感染再生细胞， cccDNA继续复制。所以HBV cccDNA很难消失。
资料表明，cccDNA的半衰期为33～70天，只要肝细胞中还存在cccDNA，乙肝病毒的复制就不会停止，即使在药物的强烈抑制下，肝细胞中的cccDNA仍然在少量复制，补充到cccDNA库中。因此停用药物后，多会恢复复制。IFNα由于有免疫调节作用，因此在停药后会有持续效应，能持续抑制cccDNA的复制，最终耗竭cccDNA库，从而使cccDNA消失。不过一般多需要较长期用药。而拉米夫定虽然在用药时对cccDNA抑制作用强，但由于它没有免疫调节作用，停药后也就没有后续效应，从而很难耗竭肝细胞内cccDNA库，因此停药后很容易复发。
CccDNA的消亡取决于感染肝细胞。慢性乙型肝炎患者，5～40%的肝细胞被感染乙肝病毒。感染肝细胞源源不断地复制cccDNA，并分泌到血清中。血清HBV DNA的转换半减期是1.2日;也就是说，血清中HBV DNA在1天以后，约有50%是新复制的病毒。正常情况下，健康肝细胞的半衰期是200余天。 而慢性乙型肝炎，在炎症活动时，肝细胞破坏、坏死较快，半衰期约为10天，因此每日可减少7%的感染肝细胞(此时如不治疗，再生肝细胞仍可被感染);如果炎症静息，肝细胞的破坏延缓，半衰期约为100天，这样每日可减少0.3%的感染肝细胞。由此可见感染肝细胞的清除是非常缓慢的，而再生肝细胞或子代细胞又被再感染，因此cccDNA很难彻底消亡，可以说，cccDNA和肝细胞是“共存亡”。尤其是炎症静息时，感染肝细胞相对长寿命，cccDNA更难清除。
在我国，慢性HBV感染很难清除，有三个原因：1、如上所述，cccDNA很难消亡。2、我国病人多位婴幼儿时期感染，在长期慢性携带后发病，都有不同程度的免疫耐受性，因此和西方病人相比，我国病人的血清抗体转换率低，复发率高。3、部分病人，HBV DNA早期整合到感染肝细胞的细胞核染色体中，成为肝细胞染色体的组成成分，此后随着肝细胞染色体的复制、分裂而复制、分裂，不能清除。
IFNα具有抗病毒作用和免疫调节作用。IFNα是通过激活抗病毒蛋白，后者再抑制乙肝病毒RNA转录而发挥抗病毒作用，实际上这也是广义的免疫调节作用。病人的基础免疫水平决定了IFNα可能激发的抗病毒免疫水平;而病人经IFNα激发的抗病毒免疫水平决定了其治疗效应和疗效稳定性。
总之， 由于HBV cccDNA的复制是不会停止的;而且在肝脏炎症趋向缓解时，感染肝细胞相对长寿命，cccDNA更难清除;另外我国慢性乙肝病人多有不同程度的免疫耐受性;而IFNα的抗病毒活性尚不够强，因此应该考虑，IFNα的用药方法应该如何改进?
那么，如何提高IFNα治疗慢乙肝的疗效呢?关键的问题是：IFNα能否充分激发机体的免疫水平?以及IFNα是否已经充分激发机体的免疫水平?
目前提出的IFNα治疗慢性乙肝的常规方案是：5MU/次，疗程6个月。国内有的专家提出IFNα合并胸腺肽治疗，这只是一种试探性的治疗方案，疗效并不肯定，目前的重点还是从提高IFNα本身的治疗效应来考虑。
首先选择适应病例可提高IFNα的效应率。适应病例是指基础免疫免疫水平较高的病人，表现为转氨酶升高，肝炎症≥G2级。有条件的病人，应尽可能作肝穿刺了解炎症程度，建议使用IFNα治疗的病人，肝炎症至少≥G2级，最好是≥G3级。IFNα的治疗效应，与肝组织学炎症有显著相关性。炎症在G3以上的病例，相当部分(30～40%)可在IFNα治疗3～6个月内获得完全应答，继续巩固治疗3个月，长期疗效稳定可靠;而另外治疗6个月获得部分应答的病例，或者G3以下的病例，6个月的疗程是不足够的，需要继续治疗，只要在治疗过程中病毒量持续降低，那么延长疗程可提高完全应答率。可通过延长疗程、增加剂量及改进方案来充分激发病人的免疫应答。
病例224932王OO，HBeAg(+)，转氨酶140左右，肝炎症G1S0，病人要求使用IFNα治疗。治疗1年以后，无明显效果。停用IFNα，改用拉米夫定治疗一段时间，HBV DNA转阴，ALT有所下降，HBeAg仍然(+)。继续拉米夫定治疗至3年时，出现YMDD变异， HBV DNA转阳并超过原复制水平，ALT升高至800左右，并出现黄疸，说明肝炎加重。遂加用甘利欣治疗，转氨酶下降，黄疸消退。一周后病人因参加考试停止使用甘利欣。3天后，病人出现急性肝衰竭症状，转氨酶再度升高，黄疸再现，且黄疸升高超过转氨酶，且PT值升高。此时肝穿显示肝炎症为G4S4。再次加用甘利欣治疗，肝衰竭症状在2周后被控制。停用甘利欣后，改用IFNα和拉米夫定联合治疗(拉米夫定一直未停药)，IFNα治疗2月后，转氨酶恢复正常，HBV DNA转阴，HBeAg转阴，HbeAb转阳。停用拉米夫定，继续单独使用IFNα至今，目前病人病情稳定，无复发。
此病例说明：(1)肝组织炎症明显时，适合IFNα治疗，疗效好。(2)拉米夫定引起的YMDD变异，有可能导致病情加重，甚至出现肝衰竭，因此需警惕。
病例222385郭OO，治疗前为肝炎症为G4S4。使用IFNα治疗6个月，治疗结束时ALT恢复正常至36，HBV DNA阴转，HBeAg阴转。停药后6个月、12个月两次随访，ALT继续下降至30和18，HBV DNA和HBeAg均保持阴性，肝炎症明显改善，为G2S3。
近三年来，我们治疗了191个病例，到目前为止统计患者治疗一年时的有效率可达到57%。看下表：慢性乙型肝炎IFNα治疗结束时的效应(191例)
此表说明：在治疗6个月时，有61例达完全应答，占191例病人中的32%;有30人因治疗无明显效果而停药;其余100人达部分应答，继续治疗。当疗程达到9个月时，这100人里又有20人达到完全应答，有22人无明显效果停止治疗，其余58人为部分应答而继续治疗。当疗程达12个月时，58人中又有28人达到完全应答，14人停止治疗，16人为部分应答，现仍在继续用药中，其中5人已用药两年。统计治疗12个月时的总完全应答率达到57%(191例病人中有109人达到完全应答)。
由此可见，对部分病人来说，要充分激发机体的免疫活性，可能需要较长疗程、较大剂量的治疗，维持IFNα较稳定的血液浓度，坚持治疗，是有可能获得完全效应的。也就是说，IFNα的疗程应个体化。
目前治疗慢性乙型肝炎完全应答定义为：①HBeAg阴转②血清HBV DNA<0.5pg/ml③ALT<1.5×ULN。资料表明，一般情况下，要达到完全应答，IFNα疗程范围为1～20个月，中位数为6个月。在达到完全应答的所有病例中，约2/3疗程在6个月之内，还有1/3疗程超过6个月。如病例267129易OO，G3S3，IFNα治疗2年达到完全应答。
以上资料说明，在实际临床治疗中，IFNα的疗程应个体化，而不能拘泥于6个月疗程。IFNα延长疗程的指征是：①根据基础免疫水平，可提示IFNα可能激发的抗病毒免疫水平。肝炎症>G2者;ALT反复增高1年以上，水平常>2.5×ULN者;干扰素治疗的免疫激发期中ALT增高明显者;说明基础免疫水平较高，适合IFNα治疗，延长疗程可提高效应率。②IFNα治疗过程中病毒水平逐渐下降者，延长疗程可提高效应率。③治疗中未出现中和抗体者。如果出现中和抗体，可能影响疗效，可停药。一段时间后复查，若中和抗体消失，可重复治疗，仍然有效。至于结合抗体，认为其对疗效无影响。
建议IFNα的最佳疗程是：在达到完全应答后，再继续治疗3个月，方可停药。
总之，使用IFNα治疗慢性乙肝，首先要选择符合适应症的病例，其次疗程应个体化，另外应密切观察治疗过程。
附：
中华骨科杂志
CHINESE JOURNAL OF ORTHOPAEDICS
1999年 第19卷 第1期 Vol.19 No.1 1999
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两种新型IFNα的克隆、表达及其抗骨肉瘤活性 吕海 金大地 史占军 景宗森 郑燕芳 马学军 侯云德 【摘要】目的 构建两种新型IFN突变株及其母体的原核表达系统，表达后对比检测其抗骨肉瘤活性。方法 以重组噬菌体pCANTAB5E－IFNs为模板，PCR扩增出两种IFNα1c/86D突变株及其母体的DNA序列，插入原核表达载体pBV3203。表达、纯化后进行SDS－PAGE电泳鉴定、Westernblot检测其免疫活性、MTT比色法对比检测其抗骨肉瘤细胞（OS732）增殖的活性。结果酶切及PCR鉴定证明IFNs在表达载体上均已克隆成功。两种突变IFNs的抗骨肉瘤活性分别比IFNα1c/86D提高4和16倍。结论 两种新型IFNs突变体的原核高效表达系统构建成功，体外实验中证明其IFNs蛋白产物抗OS732细胞增殖的活性高于母体。 Cloning and Expression of Its Anti-osteosarcoma Bioactivity of Two New Types of IFNα
【Abstract】 Objective In this study two prokaryotic expression systems of novel IFN mutants were constructed. After expression, the targetproteins were purified, and then their anti-osteosarcoma biological activity was compared with the parent substance. Methods Recombination phagemid－pCANTAB5E－IFNs were used in polymerase chain reaction (PCR) designed for specific amplification of two IFNα 1c/86D variants and their parent substance DNA sequences. Then the sequences were cloned into the bacterial expression vector－pBV3203, after induction, IFNs was secreted into the periplasm of JM103. Recombinant human IFNs(rhIFNs) were characterized by SDS/PAGE and Western blot as a monomeric 19× 10 3 protein expression and purification. The three IFNs' anti-proliferation of osteosarcoma cell (OS732） were compared by MTT(3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay. Results Restriction endonuclease digestion proved the success of IFNs DNA cloning pBV3203. Two IFNα 1c/86D variants were selected, of which the anti-proliferative activity on OS cell line were 4 and 16 fold more than IFNα 1c/86D. Conclusion The two new types of IFN mutants expression systems were constructed accurately, and the anti-osteosarcoma bioactivity of these two mutants was higher than their parent. 干扰素（interferon,IFN）目前已广泛应用于白血病、卡波济肉瘤及骨肉瘤等多种肿瘤的治疗，但IFN的生物学活性还有待进一步提高[1－3]。在前期研究中，我们利用噬菌体表面呈现技术（phagedisplay），对人重组IFNα1c/86D（rhIFNα1c/86D）上的受体结合位点（AB环）进行了随机突变(在突变库随机选取了10个克隆进行测序鉴定，发现每个干扰素克隆的29、31、32、35位氨基酸序列都发生了随机突变，其对应的核苷酸序列各不相同。具体实验过程另文报道[4])。并在骨肉瘤细胞—OS732上筛选出两个抗肿瘤活性较高的噬菌体—干扰素突变株（phage－IFNα1c/86DOS1、phage－IFNα1c/86DOS2）。本实验中，我们将这两个突变株的干扰素基因克隆于高效原核表达载体—pBV3203[5]；原核表达、纯化后与突变母体—IFNα1c/86D进行对比，体外检测其抗OS732细胞增殖活性。 材料与方法 一、菌株、载体、细胞
五、IFN的原核表达及蛋白质的提取纯化采用盐酸胍裂解法[5]。 结果 一、IFNs克隆入pBV3203表达载体
二、IFNs的表达、纯化及鉴定 IFNPr.mg/ml=1.45×OD280－0.74×OD260 得到的IFN浓度为：(7.82±3.00)μg/ml。IFNs粗制品经SDS－PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，可见多出一条相对分子质量约19×103的条带（图4）；纯化品经电泳、转膜、免疫检测后，在相对分子质量为19×103处可见一阳性条带（图5）。为人IFNα1c/86D及其突变株的电泳产品。
三、IFNs的抗OS732细胞增殖活性
A为正常细胞的OD570值；B为上样细胞的OD570值。发现每孔加入IFNα1c/86DOS11.53ng，IFNα1c/86DOS26.11ng即可使OS732细胞生长抑制率达50％以上；而IFNα1c/86D母体则需加入24.44ng才达到同样的抑制效果（表1，图6～8）。两种突变体分别比其母体的抗骨肉瘤活性提高了4和16倍。 表1不同IFNs抗OS732生长抑制率(％) |
Hai , JIN Dadi, SHI Zhanjun, et al.
| IFNs种类 | IFN含量(ng) | 0.38 | 1.53 | 6.11 | 24.44 | 97.75 | 391 |
| IFNα1c/86D | 8 | 6 | 25 | 51 | 62 | 66 | |
| IFNα1c/86D OS1 | 27 | 55 | 63 | 67 | 69 | 71 | |
| IFNα1c/86D OS2 | 7 | 31 | 58 | 64 | 68 | 70 | |
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讨论 一、IFN的生物活性 作者单位：吕海、金大地、史占军、景宗森 510515广州，南方医院骨科； 参考文献 1 曹广文,杜平,戚中田,等.现代癌症生物治疗学.第1版.北京：人民军医出版社,1995.192－263. (本文编辑：胡慧敏) |
